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研究背景眼科最常见致盲眼病有白内障、青光眼、糖尿病视网膜病变和黄斑病等，其中青光眼是继白内障后的第二致盲原因，我国青光眼的发病率为0.52%，患病人数约为700万。xx年资料显示世界青光眼发病人数到xx年将达到7000万，双眼盲目人数达到840万(quigley et al.，xx)。众多的青光眼患者和青光眼盲者，不仅给患者带来极大的身心痛苦，而且还造成社会和经济的巨大负担，因此，预防、控制及治疗青光眼十分重要且迫切!青光眼是一种由于病理性眼压增高导致的具有特征性视神经结构损伤和视野缺损为表现的神经性退行性视神经病变，其最终的结局是视网膜神经节细胞(rgcs)凋亡、视功能逐渐丧失(buckingham et al.，xx)。目前已有大量保护rgcs的研究结果，主要包括：改善视乳头微循环、谷氨酸途径抑制剂、神经营养因子，诱导热休克蛋白表达及抗氧化治疗等。然而，青光眼的发病机制至今尚未完全阐明。信号转导、受体通道研究在rgcs损伤与保护中的作用近年来正得到关注。最新的研究方向和靶点之一是关于能感受压力的受体通道可能参与传递病理刺激造成神经损伤(quigley et al.，xx)。trpc6(transient receptor potential，c6)是一个新发现的、压力敏感、参与神经元存活与凋亡的钙离子通透膜通道蛋白。本人曾参与课题"trpc6通道在视网膜缺血再灌模型中对视网膜神经节的保护作用"的研究，并获得了有价值的前期研究结果：较为全面而精确的定位了trpc6通道基因和蛋白在sd大鼠视网膜、尤其是rgcs上的表达和分布，trpc6在rgc层上有选择性的高表达;探讨了trpc6在大鼠视网膜缺血再灌(ischemia reperfusion,ir)损伤过程中的表达变化，trpc6基因和蛋白在视网膜缺血损伤中的再灌注后24小时，出现一过性的表达升高;在体的药理学实验结果显示，其激动剂oag具有保护视网膜ir模型诱导的rgcs免受损伤，而拮抗剂skf96365则促进了rgcs凋亡的发生，本研究拟进一步探讨trpc6的作用机制。研究发现，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,bdnf)与trpc通道在信号转导、调控细胞存活的过程中有密切的联系。xx年4月中国科学院上海神经科学研究所王以政研究员课题组在nature neuroscience上发表论文，首次证实过表达trpc6/trpc3可保护小脑神经元对抗因血清剥夺而导致的细胞死亡，且发现bdnf位于trpc3/6介导的细胞保护信号通路的上游(tai et al.，xxa;jia et al.，xx)。本课题拟探讨bdnf介导trpc6通道蛋白保护视网膜跟模型诱导的rgcs免受损伤的作用机制，对深入阐明青光眼的发病机制，为临床干预治提供新的思路和药物干预靶点，具有一定的现实意义。本课题的研究主要分为以下二部分：第一部分视网膜ir模型中调控trpc通道时bdnf的表达变化一、研究目的在sd大鼠视网膜ir模型中检测bdnf基因不同再灌注时间点的表达变化，同时检测抑制trpc通道时bdnf蛋白水平变化、探讨其表达类型对rgcs凋亡的影响。
二、研究方法：
1、在视网膜ir模型中检测bdnf基因的表达。采用视神经血管钳夹法建立视网膜ir模型，夹闭视网膜血供60分钟，分别于再灌注后3小时、24小时、48小时、7天处死大鼠，摘取眼球，显微镜下剥离视网膜，提取视网膜总rna，利用反转录多聚酶链反应(rt-pcr)及实时荧光定量pcr(real-time pcr)测定bdnf基因表达变化。
2、抑制trpc通道时检测bdnf蛋白的表达。建立大鼠视网膜ir模型，于视网膜缺血术前30分钟，右眼通过玻璃体腔注射trpc拮抗剂skf96365为实验组，左眼注射溶剂pbs为阴性对照组，分别于再灌后3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时处死大鼠，摘取眼球，显微镜下剥离视网膜，提取视网膜总蛋白，蛋白质免疫印迹(western blot)检测bdnf在视网膜组织中的蛋白表达水平。
3、抑制trpc通道时检测bdnf基因的表达。将sd大鼠分为4组，分别进行如下处理：第一组，对眼球进行假手术，只行视神经分离术，不行视网膜缺血手术;第二组，建立视网膜ir模型;第三组于视网膜缺血术前30分钟，通过玻璃体腔注射pbs溶液，然后再建立视网膜ir模型;第四组于视网膜缺血术前30分钟，通过玻璃体腔注射注射skf96365，然后再建立视网膜ir模型。所有大鼠于再灌注后24小时处死，摘取眼球，显微镜下剥离视网膜，提取视网膜总rna，real-time pcr测定bdnf基因表达变化。
三、研究结果rt-pcr及real-time pcr结果显示bdnf mrna在再灌注后3小时开始出现升高，24小时出现表达高峰，是对照组的1.4倍(p<0.05，n=6);western blot结果显示应用skf96365抑制trpc通道后，bdnf的前体蛋白(precursor for bdnf，probdnf)表达量升高，并于再灌注后24小时达到高峰，是对照组的1.4倍(p<0.05，n=6)，而成熟型bdnf(mature bdnf，mbdnf)在整个再灌注过程中未见明显变化。缺血再灌注24小时，ir+skf96365组bdnf的基因表达水平分别是假手术组、ir组、ir+pbs组的2.7、1.7、1.4倍，与ir+pbs组有统计学差异(p<0.05，n=6)。共2页，当前第1页12
